CRISPR/Cas9載體屬于幾種新興的基因組編輯工具之一，可以快速有效地在基因組的靶位點產(chǎn)生突變（另外兩種應(yīng)用廣泛的是ZFN和TALEN）。這些質(zhì)粒載體編碼序列特異性RNA介導(dǎo)的DNA核酸酶（或切口酶），可用于編輯基因組中特定位點的DNA序列。

Cas9屬于RNA引導(dǎo)的DNA核酸酶，是天然原核免疫系統(tǒng)的一部分，賦予細(xì)菌對質(zhì)粒和噬菌體等外源遺傳物質(zhì)的抗性。在細(xì)胞內(nèi)，Cas9核酸酶與引導(dǎo)RNA（gRNA）形成復(fù)合物，該復(fù)合物通過與基因組中的18-22 nt的同源靶序列直接相互作用提供靶向特異性。gRNA與靶位點通過互補(bǔ)配對使Cas9定位到靶序列上，然后切割基因組中的靶位點。

常規(guī)質(zhì)粒gRNA特異性檢測載體設(shè)計用于測試CRISPR/Cas9對一個或多個gRNA靶序列的切割效率。該系統(tǒng)允許用戶通過比對多個gRNA靶位點來篩選出最有效的CRISPR/Cas9靶點。

常規(guī)質(zhì)粒gRNA特異性檢測載體系統(tǒng)的基礎(chǔ)是位于強(qiáng)啟動子EF1A下游的無活性且分隔開的EGFP ORF。將待測試的gRNA靶位點克隆在兩個不完整的無功能性的EGFP ORF（稱為EGFP-L和EGFP-R）之間。EGFP-L由EGFP ORF的上游468 bp組成，EGFP-R對應(yīng)于EGFP ORF下游的268 bp-720 bp。EGFP-L的3'末端的200 bp與EGFP-R的5'末端的200 bp具有序列同源性。

當(dāng)常規(guī)質(zhì)粒gRNA特異性檢測載體單獨轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中時，不會觀察到綠色熒光，因為EGFP-L和EGFP-R都不編碼功能性熒光蛋白。然而，如果將該載體與Cas9和相應(yīng)的gRNA載體一起共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，則gRNA-Cas9復(fù)合物將被募集到EGFP-L和EGFP-R之間的gRNA靶序列，從而切割產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂（DSB），隨后EGFP-L和EGFP-R的同源區(qū)域發(fā)生同源重組。同源重組將產(chǎn)生完整的功能性EGFP ORF，繼而產(chǎn)生綠色熒光蛋白。在該系統(tǒng)中，可以在EGFP-L和EGFP-R之間串聯(lián)克隆多個gRNA靶位點（每個都應(yīng)包含PAM序列），并且可以通過與Cas9和相應(yīng)的gRNA共轉(zhuǎn)染分別測試。通過分析產(chǎn)生EGFP熒光細(xì)胞的效率，比較不同gRNA靶位點被CRISPR/Cas9切割的效率。

關(guān)于該載體系統(tǒng)的更多信息，請參考以下文獻(xiàn)。

該載體系統(tǒng)設(shè)計用于通過觀察EGFP熒光，比較哺乳動物細(xì)胞中CRISPR/Cas9 gRNA的切割效率。該常規(guī)載體技術(shù)簡單，易于使用。

測試系統(tǒng)簡單：使用該系統(tǒng)分析gRNA靶點切割效率簡單、快速。

靈敏且穩(wěn)定：即使在拷貝數(shù)非常低的細(xì)胞中，EF1A強(qiáng)啟動子和EGFP熒光的穩(wěn)定表達(dá)的特性也有助于檢測到熒光信號。

技術(shù)簡單：常規(guī)轉(zhuǎn)染即可把質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞，相比起病毒載體需要進(jìn)行病毒包裝，過程更簡單。

系統(tǒng)簡化：在常規(guī)質(zhì)粒gRNA特異性檢測載體中，gRNA靶序列與基因組中目的基因的遺傳背景不同。在進(jìn)行測試時，gRNA特異性檢測載體可以以高拷貝的形式存在于細(xì)胞中。在該測試系統(tǒng)中，CRISPR/Cas9對靶位點的切割效率可能在某種程度上會發(fā)生改變。

無法檢測脫靶效應(yīng)：該系統(tǒng)僅能檢測CRISPR/Cas9對gRNA靶位點的切割效率，而無法提供關(guān)于脫靶效應(yīng)的數(shù)據(jù)。

EF1A promoter: Human eukaryotic translation elongation factor 1 α1 promoter. A strong, constitutive promoter driving the expression of EGFP-L:gRNA Target:EGFP-R cassette.

Kozak: Kozak consensus sequence. It is placed in front of the start codon of the ORF of interest to facilitate translation initiation in eukaryotes.

EGFP-L: Corresponds to positions 1-468 bp of the EGFP ORF. This does not encode a functional fluorescent protein.

gRNA Target Sequence: The gRNA target sequence to be tested is cloned here. Multiple gRNA target sequences can be cloned here in tandem. PAM sequence must be included.

EGFP-R: Corresponds to positions 268-720 bp of the EGFP ORF. This does not encode a functional fluorescent protein.

SV40 late pA: Simian virus 40 late polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

CMV promoter: Human cytomegalovirus immediate early promoter. It drives the ubiquitous expression of the downstream marker gene.

Marker: A drug selection gene (such as neomycin resistance), a visually detectable gene (such as mCherry, should avoid green fluorescent protein), or a dual-reporter gene (such as mCherry/Neo). This allows cells transduced with the vector to be selected and/or visualized.

BGH pA: Bovine growth hormone polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.